近期， Agena公司与国内知名的肿瘤分子诊断实验室 -- 金域检验基因组中心在MassARRAY核酸质谱平台上共同开发了EGFR基因突变检测panel——UltraSEEK EGFR panel，用于非小细胞肺癌（NSCLC）患者酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向药物用药指导与监控的临床研究。

该检测panel结合MassARRAY核酸质谱多重检测及UltraSEEK试剂盒超高灵敏度的技术特点，仅需10~20ng血浆ctDNA，即可在同一个反应中同时检测6个TKIs敏感性和耐药性突变位点，检测灵敏度可达0.1%，并大大降低了检测成本。通过真实临床样本的小规模验证，UltraSEEK EGFR panel与数字PCR检测结果高度一致，被认为是一款潜在的多（多重检测，一个反应覆盖多个关键突变位点），快（检测周期短），好（物理检测，结果准确，重现性高），省（节省样品，节省检测成本）的NSCLC伴随诊断检测产品。

TKI一直是EGFR突变型NSCLC靶向治疗中的重要药物，但是***代和第二代TKI治疗下的病人，往往会在平均10个月左右出现耐药性进展。在所有的耐药机制中，EGFR T790M突变占60%左右的比例。阿斯利康开发的第三代TKI 泰瑞沙/ Tagrisso（又名奥希替尼/Osimertinib）是可以有效应对T790M突变的新一代靶向药物，在包括中国在内的全球多个国家获得了监管部门的批准，可以用于原有TKI治疗耐药后的进一步治疗，并可显著延长病人的无进展生存期（PFS）等临床指标，拥有着广阔的市场前景。

随之而来的，是一个同样广阔的伴随诊断市场。在病人的治疗过程中，如何能够精准、廉价、无创地检测到T790M突变的存在，既关乎治疗的效果，又关乎治疗费用的有效利用。在这个舞台上，已经涌现了各种各样的***技术。

例如，在一举奠定泰瑞沙诊疗效果地位的重要临床研究AURA3中，临床工作者们选用了经典的ARMS PCR技术，亦即Roche公司的cobas® EGFR Mutation Test进行T790M检测。该方法可同时检测包括T790M、L858R、Exon19缺失在内的多种EGFR突变，也获得了FDA的扩展批准，应用于Tagrisso的伴随诊断。但是受限于技术原理，ARMS PCR目前对低频突变的检出频度大约在1%~ 2%水平。AURA3论文中，作者们不无遗憾地写下：” However, because of the high false negative rates with plasma ctDNA T790M testing, the analysis of a biopsy sample is recommended for patients with a plasma T790M-negative result who have disease progression after receiving first-line EGFR-TKI（但是，由于当前血浆ctDNA中的T790M检测假阴性率太高，对那些在一线TKI治疗中出现疾病进展、血浆中T790M为阴性的病人，仍然推荐进行组织活检突变检测）”。一种灵敏度更高的检测技术，可以检出更多的低频T790M突变，也就有更多的病人可以免受穿刺组织活检之苦。

也正因为这个原因，很多实验室采用了更为灵敏的ddPCR技术进行T790M检测，其灵敏度可达到0.1%，亦即真实临床场景内肿瘤突变在血浆ctDNA中出现的频度下限。但是目前ddPCR技术不具备进行多重检测性能，每次反应只能检测一个突变，无法在一个反应中同时检测原有敏感性突变和其它耐药性突变的信息。在2017年的Precision LBx Summit（精准液体活检大会）上，来自于阿斯利康的肿瘤转化医学总监在其报告中明确提出”Beyond T790M: Detection of EGFR sensitizing mutation as a control”，利用EGFR原有敏感性突变，作为血浆ctDNA检测的阳性内参，一方面排除检测失败带来的假阴性结果，另一方面在之前的研究中已有证明，T790M与敏感性突变均为阴性的病人，比T790M阴性、敏感性突变阳性的病人，拥有更高的治疗响应率与更长的无进展生存时间（4.4个月 vs 15.2个月），对比数据请见图1。

图1：敏感性突变对T790M突变患者PFS的影响

此外，还有NGS、Beaming等技术可以完成T790M的检测，但都因为价格昂贵、报告周期长等原因，无法很好地满足一线临床检测的需求。

那么，鱼与熊掌，是不是真的就不可兼得？到底有没有一种快速、廉价、灵敏度可以达到0.1%、使用少量ctDNA样本就能一次性同时检测数个敏感/耐药突变的技术手段呢？

MassARRAY 核酸质谱分析系统，图片来源：Agena官网

早在2016年，Agena Bioscience公司就基于MassARRAY核酸质谱平台推出了超高灵敏度、多重检测血浆中游离DNA突变的检测试剂UltraSEEK。它同样基于MassARRAY核酸质谱经典的多重PCR + 多重单碱基延伸 + 基于分子量差异的基因分型，但是为了检测到极低丰度的肿瘤DNA突变，在UltraSEEK试剂中，在原有检测技术基础上做了巧妙的改进，使得只有携带突变的DNA模板得以延伸，有效地抑制了高丰度野生型模板带来的信号干扰，再利用生物素标记、亲和素磁珠等方法对突变模板延伸产物进行富集，以实现对低丰度突变位点进行准确、可靠地检测，避免了“大海捞针”式地检测，带来了灵敏度上的新突破。

UltraSEEK试剂突变检测流程，图片来源：Agena官网

利用UltraSEEK，Agena Bioscience于近期成功开发了针对EGFR T790M耐药突变及其他关键突变位点的UltraSEEK EGFR Panel，该panel涵盖了主流的三种敏感性突变（L858R，E746_A750del c.2235_2249del15和E746_A750del c.2236_2250del15，三种突变可覆盖超过90%的EGFR敏感性突变），T790M以及针对Tagrisso的耐药突变C797S（c.2389T>A 和c.2390G>C）。使用10-20ng ctDNA模板，单次多重PCR扩增，即可在一次反应中同时检测到这6种突变。

为了验证该panel在临床上的实际应用，Agena公司与国内知名的肿瘤分子诊断实验室金域检验基因组中心开展了一次小规模验证比对实验，取得了显著的结果一致性。

该实验中共随机挑选94份血浆ctDNA样本，每个样本均来自于临床TKI治疗进展的NSCLC病人，并已经由ddPCR进行了T790M检测。利用UltraSEEK EGFR Panel，研究人员进行了6种EGFR突变的多重检测。在T790M检测中，两种检测方法获得了超过97%的结果一致性，检测灵敏度均达到0.1%，并在相对频度计算方面同样表现出很高的一致性。与此同时，UltraSEEK EGFR Panel多检出了42个敏感性突变，以及一个C797S突变。整个实验可在1.5个工作日之内完成从样本到输出结果报告，大大缩短了检测周期。

由此可见，灵敏度与多重检测并不是“非此即彼”的关系，多重性好、性价比高的MassARRAY平台、灵敏的UltraSEEK技术，结合在一起就可以获得“鱼与熊掌”兼得的检测产品，为研究人员多快好省地解决临床工作中Tagrisso的伴随诊断需求。