转录组分析的挑战

如今，常规的RNA测序均需要将RNA转化为互补DNA（cDNA）链进行。而在这个过程中，并不是所有的转录物都能以相同的效率扩增，这就会导致一些种类的RNA的中断，以及其它种类RNA的过度扩增，从而引入逆转录或扩增偏倚。研究表明，与总mRNA混合物相比，经PCR扩增文库的多样性有降低的趋势。此外，使用短读长测序技术会产生GC偏好性，产生的数据不能很好的代表GC含量低或含量高的序列。

基于cDNA研究的另一个局限性，是在PCR扩增过程中会丢失有关碱基修饰的所有信息。这种碱基修饰由于具有调节RNA活性和稳定性的作用，已经开始受到研究人员越来越多的关注。

纳米孔技术可实现直接和实时的全长转录本测序 

目前，由Oxford Nanopore Technologies公司开发的纳米孔技术是***可以直接测序RNA的测序技术。直接RNA测序能够消除造成潜在偏倚的因素。

MinION测序仪是***款纳米孔测序设备。它是一款便携式、实时、超长读长和低成本设备。它能产生超长读长的特点也使得它能够对全长转录本进行测序。纳米孔测序也被用于高通量cDNA测序，使用基于PCR的“链转换法”，或者是无PCR的直接cDNA测序，进行全长转录本的分析。

在使用纳米孔测序技术时，读长的长度仅仅受限于出现在纳米孔中的RNA（或DNA）片段的大小，这使得它可以测序非常长的全长转录本。目前直接RNA测序能够处理的***长转录本长度超过了20kb。全长cDNA可以作为单个片段进行测序，大幅减少了之后进行的多位点比对中的问题。

在***近由Oxford Nanopore主办的London Calling 2018会议上，来自Nanopore Human RNA Consortium（纳米孔人类RNA联盟）的Angela Brooks详细介绍了他们使用MinION对人类GM12878细胞系的多聚腺苷酸化天然RNA进行测序的工作。他们分析了1300万个天然RNA序列读数，其中包括了长达22kb的全长转录本、选择性剪接异构体、poly-A尾长和RNA修饰。另外，他们还从相同的RNA样品获得约了2400万个cDNA纳米孔读数，然后对两种转录组分析方法进行了比较。Angela表示：“天然RNA测序是一项非常有前景的技术，可以用来研究全长异构体，等位基因特异性表达，poly-A尾长度估算，也可以用来研究RNA修饰和编辑。”

RNA直接测序的测序数据还能够用于检测表观遗传修饰。纳米孔测序不需要扩增或链合成，这意味着在测序过程中，修饰碱基能穿过纳米孔，并能在原始信号中检测到独特的信号特征。Oxford Nanopore开发了一种名为Tombo的分析工具，可通过直接RNA或DNA测序检测碱基修饰[4]。Tombo允许研究人员用不同的计算方法研究修饰的碱基，针对不同应用类型和实验设计具有灵活性，还可以通过训练该平台来识别更多的非标准碱基。到目前为止，使用纳米孔测序技术检测到的RNA修饰包括了假尿苷、N6-甲基腺苷（m6A）及5-甲基胞嘧啶（5mC）。

如今，RNA直接测序技术已被临床研究人员用来开发病毒病原体检测的新方法，大幅缩短得到检测结果时间。在***近的一项有关流感病毒的研究中，美国疾病控制和预防中心的研究人员研究出了一种RNA直接测序方案，***对病毒全基因组进行了测序，并且将病原体检测和鉴定时间从几天减少到了几个小时。

在一项英格兰公共卫生署（PHE）的研究中，以Liana Kafetzopoulou为首的研究团队利用MinION进行了病毒的宏基因组测序，直接从基孔肯雅病毒、登革热病毒和拉萨热病毒临床样本中对完整的RNA病毒基因组进行阐述。使用Oxford Nanopore的快速测序试剂盒进行10分钟的文库制备后，他们在共同感染样品中检测到了基孔肯雅病毒和登革热病毒。在2018年2月，尼日利亚爆发了有史以来***大的拉萨热。Liana和她的团队使用便携式MinION设立了现场实验室，在爆发后的8周内对35个样品进行了完整的基因组分析。

目前，Oxford Nanopore提供不同的测序试剂盒用于不同的RNA测序应用，包括基因表达、剪接变体和融合蛋白、病毒RNA以及直接RNA测序分析碱基修饰。对更高通量需求的实验，还可以升级到台式设备GridION和PromethION。这两款台式高通量测序仪使用的是和MinION一样的核心技术，可以分别运行多达5个和48个测序芯片。每个测序芯片可以独立使用，可以同时运行不同的实验。