动物模型作为医学及生命科学研究中不可或缺的研究工具，其中结合基因编辑技术制备的【基因修饰小鼠】拥有许多类型，包括转基因、基因敲除、条件敲除、点突变、基因敲入等。

转基因小鼠

基因过表达研究好能手

转基因小鼠常用于基因的过表达。根据制备策略，分为随机转基因和定点转基因。随机转基因是将过表达载体注射到受精卵中，表达载体以随机方式插入基因组，首建鼠可能有多个位点插入，每个插入位点可能含有多个表达载体拷贝。这个特点导致有的转基因小鼠会发生表达沉默，因此需要对小鼠进行表达筛选，筛出正确表达的小鼠，进行建系才能用于后续实验。定点转基因是将基因表达载体插入到基因组特定位点上，如 Rosa26 位置，研究证明，这个位置不容易发生表达沉默，与随机转基因相比，优势是表达确定，但制备相对复杂，成本和周期增加。

图 1：转基因小鼠制备示意图

来源：Yale J Biol Med. 2011 Jun;84(2):117-124

基因敲除小鼠

费用逐渐降低

传统策略是通过同源重组的方式，用 Neo 基因替换或删除关键外显子来敲除基因，其周期长，费用高。TALEN，CRISPR 技术出现后，加速了基因敲除鼠的制作，而且降低了费用。CRISPR 切割 DNA 后，会引起的非同源末端修复（NHEJ），这种修复有一定的随机性，如果插入或删除非 3 的整数倍的核苷酸，会发生移码突变，造成基因敲除。移码突变的策略只需要单个 gRNA，但是后期检测一般需要测序，或者用分辨率更高的 Page 胶电泳，检测相对复杂，成本较高。

图 2：基因敲除小鼠制备示意图

这里有个需要注意的雷是某些敲除虽然发生了移码，但是蛋白水平检测发现，未能敲除目的基因。目前维通达采用双 gRNA 策略，删除关键外显子或整个目的基因，确保有效敲除目的基因，由于删除了一个大的片段，PCR 检测时，敲除小鼠很容易与野生型区别。

条件敲除小鼠

敲除致死的***模型

当目的基因敲除致死时，只能做条件敲除，常用 Cre-loxp 系统。那么如何操作呢？方法是在要敲除的区域两侧插入 loxp，得到的 floxed 小鼠与组织特异表达 Cre 的小鼠杂交，在 Cre 的作用下，两个 loxp 之间的区域被删除，可以实现在特异的组织敲除目的基因。条件敲除虽然也是敲除，但是制备这种小鼠实际是要定点插入 loxp 序列。

图 3：条件敲除小鼠制备示意图

点突变小鼠

可模拟单个碱基突变引起的疾病

某些疾病由单个碱基突变引起，通过突变小鼠的相应碱基可以模拟。CRISPR 打断 DNA 的同时，提供含有目的突变的单链修复模板，能够有效地建立点突变小鼠。影响点突变效率的主要因素是，该点突变附近有没有***率切割 DNA 的 gRNA，如果有，是比较幸运的，如果没有，可以选取邻近的 gRNA，这可能造成二次切割，需要引入同义突变。在这里提醒大家，切割位点离突变位点越远，突变效率越低。

图 4：点突变小鼠制备示意图

基因敲入小鼠

制备基因人源化小鼠

CRISPR 打断 DNA 的同时，提供打靶载体，能够敲入外源 DNA。当需要敲入长度较小 DNA 片段时，CRISPR 能够有效地提***率，如维通达制作的免疫检查点基因 PD1，CTLA4，Tim3，和 LAG3 的人源化小鼠，都是通过 CRISPR 技术，将小鼠的基因替换成人源的基因。对于 GFP 等各种标签的插入也可以用 CRISPR 来帮助制备。

图 5：基因敲入小鼠制备示意图

基于 ES 的传统打靶

EPS 细胞助力节省 3 个月研究时间

虽然 TALEN 和 CRISPR 出现后，大大提高了基因编辑的能力，但 CRISPR 等技术也并非全能。随着敲入片段长度的增加，大于 1kb 的片段时，CRISPR 等技术效率逐渐下降，而传统 ES 打靶周期长，费用高。由北京大学和维通达共同合作研发获得的 EPS 细胞（cell 期刊号：169（2）：243-257.e25.），具有超强的胚胎嵌合能力，一个 ES 细胞注入囊胚，就可以直接生出 ES 小鼠，越过嵌合鼠的步骤，节省三个月的时间，费用也大为节省。

图 6：基于 ES 的传统打靶小鼠制备示意图

多种基因修饰的研究都离不开基因的提取，磁珠法核酸提取试剂盒能够高通量自动化地进行核酸提取与纯化，有着提高研究效率的重要意义。吉恩特公司生产的生物磁珠及磁珠法核酸提取试剂盒性价比高稳定性好，深受相关实验室好评。