生命科学的迅速发展使得我们从生物遗传信息的“读取”阶段进入到后基因组时代，基因组的“改写”乃至“全新设计”正逐渐成为现实。在不断的探索研究中，基因编辑技术已经从***初依赖细胞自然发生的同源重组，发展到几乎可在任意位点进行的靶向切割，其操作的简易和***极大地推动了物种遗传改造的发展。基因编辑可为合成生命的进一步改造提供手段，为新物种的创造提供更多的可能性。

基因编辑主要包括锌指核酸酶(ZFN) 技术、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN) 技术、CRISPR-Cas核酸酶(CRISPR-Cas RNAs) 技术，它们都能特异性地识别靶位点，对其单链或双链进行精准切割后，并由细胞内源性的修复机制来完成对靶标基因的敲除和替换。由于CRISPR-Cas9系统构建相对容易且细胞毒性小，目前应用***为广泛。

（a）锌指核酸酶（ZFN）基因编辑技术；（b）TALEN 基因编辑技术；

（c）CRISPR/Cas9 基因编辑技术

CRISPR/Cas系统应用

1  CRISPR/Cas9 技术

CRISPR/Cas 系统原本是细菌和古菌进化出来用于抵御外来病毒及质粒 DNA 的适应性免疫系统。II 型CRISPR/Cas9系统依赖于外源 DNA 片段在规律成簇的短间隔回文重复（CRISPR）位点整合，其经过转录及剪切后产生短的 CRISPR RNAs（crRNAs），crRNA 与反式转录的 crRNA（tracrRNA）退火结合，然后引导 Cas9蛋白介导序列特异性的外源 DNA 降解[1]。Jinek等[2]发现Cas9 发挥靶向切割作用所依赖的 crRNA 和 tracrRNA 可以融合为一体，作为 sgRNA。随后，若干研究组陆续报道 CRISPR/Cas9 系统可用于人类细胞的靶向基因编辑[3]。

2  CRISPR/Cas9-nickase 基因编辑技术

RISPR/Cas9系统使用的 crRNA 能容受一定程度的错配导致脱靶效应的产生，***了 CRISPR/Cas9 系统在高精度编辑中的应用[4]。为了提高Cas9编辑系统的精度，研究者设计了“一个位点，双 sgRNA 靶向”的策略，即只对HNH或RuvC的其中一个位点进行沉默突变，形成和Cas9 nickase，这样就可以用两个不同的nickase对基因组进行锚定和单链剪切造成粘性末端。使用这种策略，可以大大降低CRISPR/Cas9 系统的脱靶效率。

3  CRISPR/dCas9-FoKI基因编辑技术

同样是为了解决 CRISPR/Cas9 技术的脱靶问题，Guilinger 等[5]采用了dCas9的策略，即对HNH和RuvC活性区域进行突变，使之无法行驶剪切功能而产生Dead Cas9(dCas9)，dCas9只能依据sgRNA上的序列附着到特定的基因位点上，而不可以行驶剪切功能。为了实现 DNA 的切割，引入FoKI 核酸内切酶的切割结构域，与dCas9连接做成融合蛋白fCas9。在人类细胞的基因编辑中，fCas9 的特异性比野生型Cas9要高得多，同时也大大降低了脱靶效率。

(a) CRISPR/Cas9 技术  (b)CRISPR/Cas9-nickase 基因编辑技术

(c)CRISPR/dCas9-FoKI基因编辑技术

4  基于 CRISPR/dCas9 的单碱基编辑技术

（1） Liu课题组将源自大鼠的胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）与 dCas9 融合，从而使得胞嘧啶经脱氨基形成尿嘧啶，尿嘧啶在复制过程中被识别为胸腺嘧啶，实现C到T的转换,然后在后续的 DNA 复制或者修复作用下实现 C : G 碱基对到 T : A 的转变[6]。

（2）腺嘌呤经脱氨基形成次黄嘌呤，次黄嘌呤在复制过程中被识别为鸟嘌呤，从而可实现A到G的转换。Liu 课题组采用蛋白质进化工程手段对大肠杆菌的 tRNA 腺苷脱氨酶（TadA）进行改造，他们获得的第 7 代腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editors，ABEs）能***介导 A : T 碱基对到 G : C 转变[7]。

5  基于 CRISPR/dCas9 的基因表达调控技术

除了直接对 DNA 进行编辑，CRISPR/Cas 系统在基因表达调控上也可发挥作用[8]。例如，利用dCas9无核酸内切酶活性但仍能与DNA结合的特点，可直接阻碍其结合 DNA 与其他因子的结合，影响基因的表达。如果将转录抑制因子或者激活因子与dCas9融合，则可以实现靶基因的抑制与激活，为基因功能研究提供灵活的操作手段。

6  CRISPR/Cas12a 基因编辑技术

2015 年，张锋团队报道 V 型系统中的 Cpf1（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）（现称“Cas12a”）是有功能的细菌免疫机制并能在人类细胞中介导有效的基因编辑[8]。CRISPR/Cas12a 需要的是富含 T 碱基的 PAM 序列，有助于其在基因组富含 A/T 碱基的物种中使用。陈佳课题组将无 DNA 切割活性的 dCas12a 与大鼠源的胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）融合，发现其与基于 Cas9 的碱基编辑器类似，能有效地催化人类细胞中 C 到 T 碱基的转换[9]。由于识别的是富含 T 碱基的 PAM 序列，基于 Cas12a 的碱基编辑系统能与基于 Cas9 的碱基编辑系统互补，为相关基础研究及将来的临床应用提供更***的技术条件。

7  基于CRISPR/Cas 系统的RNA编辑技术

除了对 DNA 进行编辑，张锋课题组发现 CRISPR 蛋白家族的 C2c2（现称 Cas13a）可以靶向切割 RNA[10]，随后他们证实 Cas13a 可在哺乳动物细胞中靶向降低 RNA 的水平[11]。利用 Cas13a 的 RNA 靶向功能，CRISPR/Cas13a系统被开发为 RNA 检测器用于疾病诊断[12]。张锋团队后续又发现了 Cas13b[13]，其同样具有 RNA 靶向和编辑功能。另外，Cas13c 和 Cas13d 也具有类似功能[14]。RNA 编辑技术的建立，进一步拓展了 CRISPR/Cas 基因编辑技术的应用范围。

吉恩特公司生产的生物磁珠及磁珠法核酸提取试剂盒，配合核酸自动提取仪、核酸提取工作站等可以方便地进行高通量自动化的核酸提取与纯化，对于基因相关研究都有着重要意义，对于癌症、蛋白、基因组学等多学科实验即是重要的实验工具也是便捷的技术手段。性价比高稳定性好，深受相关实验室好评。