细菌异质地激活基因表达程序，以应对环境变化、压力和其他刺激。这种行为可能作为一种两头下注策略（bet-hedging strategy），对种群的生长和生存至关重要。由于两头下注程序通常只在一小部分细胞中被激活，对它们的无偏见发现和描述仍然具有挑战性。高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）已经广泛地用于分析真核生物中的细胞类型和状态，但现有的方法不容易适用于细菌。

鉴于对细菌scRNA-seq的需求，来自美国华盛顿大学的研究人员在一项新的研究中开发出microSPLiT（microbial split-pool ligation transcriptomics, 微生物***池连接转录组），这是一种为微生物量身定做的低成本高通量方法。microSPLiT通过组合条形码对RNA的细胞来源进行标记，仅使用基本的实验室设备就可以在一次实验中对数万个细胞进行分析。microSPLiT克服了细菌特有的挑战，如低mRNA含量、细胞大小的多样性和细胞壁结构。相关研究结果发表在2021年2月19日的Science期刊上，论文标题为“Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding”。

考虑到即使是等基因细菌（isogenic bacteria）也经常表现出对适应性和生存至关重要的功能性亚群，细菌RNA测序中的单细胞分辨率缺乏是一个严重的***。基因表达异质性很可能在微生物暴露于复杂的化学、物理和生物因素的自然环境中被放大，但迄今为止，对这种功能上的变化仍然未得到较好的理解。功能性亚群可能是罕见的，难以培养，使得利用现有的基于荧光的单细胞方法分析它们面临挑战。

在用革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌进行的物种混合实验中，microSPLiT在大肠杆菌中平均每个细胞检测到235个独特的转录本，在枯草芽孢杆菌中平均每个细胞检测到397个。microSPLiT通过经典热休克基因的表达可靠地区分了热休克细菌和非热休克细菌，从而证明了它在混合种群中检测差异性基因表达的能力。

这些研究人员将microSPLiT应用于在丰富的培养基中培养的25000多个枯草芽孢杆菌细胞，并在生长曲线[光学密度（OD）0.5至6.0]上取样。microSPLiT为所有生长阶段的碳利用提供了一个***的视角，在中等光密度下检测到令人惊讶的与肌醇分解代谢相关的细胞亚群。单细胞显微镜证实了肌醇摄取和利用操作子的异质表达。microSPLiT还鉴定出与一系列细菌生活方式和应激反应相关的基因表达程序。这些数据显示，在所有细胞中，一个由少于0.2%的细胞组成的罕见亚群与原噬菌体激活（prophage activation）相关，另一个由大约2%的细胞组成的亚群处于感受态（competence）状态。这些亚群内的基因表达与之前关于感受态和原噬菌体激活的报告非常一致。

综上所述，这些研究人员开发出一种高通量细菌scRNA-seq方法，并将利用它描述枯草芽孢杆菌在丰富的培养基中的生长。这一分析揭示了几个异质性激活的基因表达程序，即便指数生长通常与细胞异质性无关。他们能够检测到在所有细菌中所占比例为0.142%的稀有细胞亚群，从而表明microSPLiT有潜力发现生理学上有重要意义的但很难通过批量或低通量方法研究的稀有细胞状态。这种microSPLiT实验方案能够可靠地分析革兰氏阴性模式菌和革兰氏阳性模式菌的混合物；他们预计，这种多功能性加上组合条形码固有的可扩展性将使得microSPLiT成为调查复杂的天然微生物群落和工程化微生物群落的强大工具。