ORF6基因是sarbecoviruses病毒家族（例如SARS-CoV和SARS-CoV-2）与其他beta属冠状病毒***重要的区别。根据***近发表在《Cell Reports》杂志上的一项研究，来自日本东京大学的Kei Sato教授及其同事揭示了ORF6编码蛋白抑制先天免疫信号的活性，例如能够抑制病毒感染后I型与 III型IFN信号的上调。此外，研究发现SARS-CoV-2来源的ORF6蛋白比其来自SARS-CoV的同源蛋白能够更加有效地抑制宿主细胞先天免疫活性。突变分析表明，E46和Q56是SARS-CoV-2 ORF6拮抗活性的重要决定因素。研究表明，ORF6的抗先天免疫活性取决于其C末端区域，该区域能够抑制IRF3的核转运活性。***后，研究揭示自然条件下发生的移码/无义突变，这些突变导致约0.2％的SARS-CoV-2毒株中的ORF6失活。

（图片来源: www.cell.com）

首先，作者评估了β冠状病毒的系统发育关系，包括SARS-CoV，SARS-CoV-2，MERS-CoV，OC43和HKU1。根据全长病毒基因组的系统树以及编码ORF1ab，刺突蛋白（S），包膜蛋白（E），膜蛋白的五个病毒核心基因的亲缘关系，对病毒株进行分类。分析显示， sarbecoviruses亚属内的不同病毒基因的系统发育存在拓扑差异特征，这与此前的研究一致。然而，某些病毒基因，例如E（在SARS-CoV-2中由 75个氨基酸组成）相对较短，因此难以可靠地推断出它们的系统发育关系。E基因的系统树中分离出了两种属于Sarbecovirus的病毒BtKY72和BM48。相比之下，其他六种系统发育树在beta冠状病毒的五个亚属之间显示出几乎相同的关系。这些结果表明，尽管重组事件可以在sarbecoviruses之间发生，但在所分析的β-冠状病毒之间并未发生病毒重组现象。

然后，作者比较了不同亚属的基因组组织结构。结果显示，核心基因（ORF1ab-S-E-M-N）的排列是保守的。 在Hibecovirus和Embecovirus成员中检测到ORF1ab和S之间存在可变开放阅读框（ORF），而在所有β冠状病毒中，S和E之间均检测到可变ORF。 然而，仅在Sarbecovirus和Hibecovirus亚属的成员中观察到M和N之间的ORF插入现象。 当比较这些ORF的序列时，Sarbecovirus中的基因与Hibecovirus中的基因不匹配，表明这些ORF在这些亚属分化之后独立出现。 值得注意的是，ORF6在包括SARS-CoV和SARS-CoV-2在内的sarbecovirus病毒中高度保守，但在其他beta冠状病毒中却并非如此。

(beta冠状病毒进化树以及基因结构图谱)

由于先前的报道表明SARS-CoV 的ORF6蛋白具有抑制IFN-I激活以及抑制ISG活性的能力，因此作者比较了代表性的Sarbecovirus ORF6蛋白的表型特性。 结果表明，Sarbecovirus ORF6基因的系统发育拓扑特征与全长病毒基因组相似，这表明在Sarbecovirus病毒中未发生涉及ORF6基因的重组事件。为了进行表型分析，作者从SARS-CoV-2（Wuhan-Hu-1）中克隆得到了ORF6的表达质粒，以及从蝙蝠（RmYN02，RaTG13和ZXC21）和穿山甲（P4L）产生的SARS-CoV-2中得到了相关病毒基因。WesternBlot结果显示，SARS-CoV-2谱系的ORF6蛋白的表达水平低于SARS-CoV谱系和两种外群病毒的表达水平。荧光素酶报告检测结果显示，ORF6能够抑制一系列IFN相关基因的表达，包括IFN-B1，IFN-L1，IFI-44L，等等。这些结果表明Sarbecovirus 来源的ORF6具有抑制IFN天然免疫信号的能力。

（ORF6抑制IFN天然免疫信号转导）

为了研究ORF6抑制IFN信号活性的内在机制，作者进行了片段缺失突变与点突变分析。结果显示，C末端的肽段对于ORF6的活性具有关键影响。进一步，作者发现其中两个氨基酸残基E46 与Q56对于该活性至关重要。

（突变分析揭示ORF6的抑制性内在机制）

***后，作者对目前流行的SARS-CoV-2中的ORF6蛋白进化特征进行了分析。结果表明，0.2% (124 /66741)的致病毒株在演化过程中由于移码突变或无义突变失去了C末端的活性，这暗示了这些变异后的毒株感染人体后或许会导致更强的IFN信号产生。