明星基因疗法公司Spark Therapeutics开发的Luxturna获得FDA批准上市，成为在美国获批的“体内给药型”基因疗法。而诺华公司开发的Zolgensma也有望在本月获得FDA批准，成为第二款“体内给药型”基因疗法。根据再生医盟（ARM）发布的报告，截至到2019年***季度末，全球有371项基因疗法处于临床开发阶段，与2018年同期相比，增长了17%。

作为递送基因疗法的有力工具，腺相关病毒（AAV）的开发和制造也成为业界的关注焦点之一。近日多家公司通过合作和并购，扩展AAV的设计和制造能力。日前，Nature Reviews Drug Discovery上发表一篇综述，通讯作者是马萨诸塞大学医学院（University of Massachusetts）的基因疗法专家高光坪教授。

腺相关病毒基本构造和作为基因疗法载体的运作机理

腺相关病毒是一种单链DNA病毒，目前的科学界共识是它不会导致任何人类疾病。它由蛋白衣壳（capside）和长度为4.7kb的单链DNA基因组构成。蛋白衣壳由三个亚基组成，分别为VP1，VP2，和VP3。AAV基因组两端为两个“T”型的末端反向重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。这两个ITRs是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。AAV基因组中的rep基因编码4个与病毒复制相关的蛋白，分别为Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40。

作为基因疗法载体的重组腺相关病毒（rAAV）携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同，然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除，取而代之的是治疗性转基因（transgene）。AAV基因组中***被保留的部分是ITRs，它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是：一方面可以***大化重组AAV携带转基因的容量，另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。

▲重组AAV载体介导转基因表达的过程

重组AAV颗粒通过与宿主细胞表面表达的糖化受体相结合，通过网格蛋白（clathrin）介导的内吞作用进入细胞。在内吞形成的内体（endosome）酸化之后，病毒衣壳的VP1/VP2部分构象发生变化，导致病毒从内体中脱离，并且通过核孔进入细胞核。进入细胞核后，单链DNA从衣壳中释放出来。这时单链DNA还不能进行转录，它们需要变成双链DNA。单链DNA可以利用宿主细胞的DNA聚合酶来合成互补链，或者两条从不同AAV颗粒中释放的互补链退火（annealing）形成双链DNA。

***新的AAV基因组设计能够将衣壳中携带的单链DNA设计成自我互补（self-complementary）的序列。这种序列的优点在于它不需要单链DNA复制成为双链DNA的步骤就可以进行转录，与传统的单链AAV基因组相比，它的基因表达更为迅速，而且表达量更高。诺华公司开发的治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的Zolgensma就使用了这种基因组设计。然而这种设计的一个缺点是AAV携带的转基因容量减半。

双链形式的AAV基因组然后利用ITRs进行分子内或分子间基因组重组，这一过程让AAV基因组成为稳定的游离DNA（episomal DNA），导致基因组能够在不再进行有丝***的细胞中持续进行基因表达。

DNA提取磁珠可以有效的从标本中提取基因组DNA、病毒DNA或游离DNA，采用化学合成的方法将四氧化三铁进行特殊的处理，使其粒径达到均一化分散，再通过特殊的材料进行官能基团（如硅羟基、羧基）的包覆。包覆官能基团后，磁珠具备了核酸吸附能力，配合核酸提取仪，可以自动化的提取DNA和RNA。