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草甘膦是许多商业除草剂中的活性成分,是全球应用***广泛的除草剂。在小麦、水稻、玉米和大豆等作物中使用草甘膦的增加与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和其他神经退行性疾病导致的死亡率增加呈正相关。此外,草甘膦暴露会增加血浆中的促炎细胞因子,尤其是TNFα(Tumor necrosis factor α)。草甘膦已被证明可以穿过血脑屏障,但尚未在体内得到验证。
异常的TNFα信号传导与许多病理有关,包括癌症、类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化症以及免疫、炎症和神经退行性疾病。在健康的大脑中,成年期TNFα的表达较低,而相比之下,成年神经退行性疾病的大脑则表现出非常高水平的TNFα。神经炎症在AD发病机制中起着核心作用,而TNFα与AD的进展密切相关。TNFα死亡结构域通路在AD中逐渐激活并导致细胞变性。鉴于草甘膦暴露与体内TNFα之间的关系,以及TNFα与神经变性之间的联系,必须确定草甘膦暴露导致大脑中TNFα水平变化。
2022年7月28日,亚利桑那州立大学研究团队在Journal of Neuroinflammation发表题为“Glyphosate infiltrates the brain and increases pro-inflammatory cytokine TNFα: implications for neurodegenerative disorders”的研究成果(图1)[1]。研究结果表明草甘膦可穿过血脑屏障并渗入大脑,提高TNF-α和可溶性Aβ的表达,并以剂量依赖的方式破坏转录组,可影响AD等神经退行性疾病。
此项研究以48只小鼠(雌雄各24只)为研究对象,探究草甘膦是否渗入大脑并提高4个月大C57BL/6J小鼠的TNFα水平。小鼠按性别和剂量分组(每笼3只小鼠)并通过口服管饲法接受125、250或500mg/kg/天的14天草甘膦处理。在给药的***后一天收集小鼠尿液、血浆和脑样本,并通过UPLC-MS和ELISA进行样本分析。原代皮层神经元来源于APP/PS1幼崽淀粉样蛋白生成,以评估Aβ40-42负荷和细胞毒性的体外变化。对C57BL/6J脑样本进行RNA测序以确定转录组的变化(图2)。
结果发现:
01 草甘膦暴露导致大脑中同时检测到草甘膦及其代谢物
草甘膦暴露剂量对脑草甘膦测量有显著主效应,增加剂量会导致大脑中草甘膦水平升高(P <0.0001)。草甘膦主要代谢物氨基甲基膦酸(Aminomethylphosphonic acid,AMPA)在大脑中有剂量的显著主效应,与对照小鼠相比,250mg/kg和 500mg/kg剂量组在大脑中的AMPA表达更高。脑组织中的草甘膦和AMPA含量之间存在强烈的显著正相关(r=0.9031,P<0.001),尿液和脑组织中草甘膦含量之间存在显著的正相关(r=0.4879,P=0.0182)。这些发现表明,草甘膦暴露会导致大脑中同时检测到草甘膦和AMPA,并且大脑中草甘膦的水平与尿液中检测到的水平相关。
02 草甘膦暴露以剂量依赖性方式增加外周血浆和脑TNFα的水平
草甘膦暴露剂量对脑匀浆、海马匀浆和皮质匀浆的TNFα水平均有显著的主效应,且TNFα水平呈剂量依赖性增加。在大脑中,TNFα的表达与神经毒性和细胞死亡有关,这些结果表明草甘膦暴露会以大脑区域特异性方式增加促炎细胞因子TNFα的水平。
03 脑草甘膦水平与外周血浆和脑TNFα水平相关
脑草甘膦和脑、外周血浆和尿中的TNFα水平均有显著的正相关,尿草甘膦水平与外周TNFα相关,而脑草甘膦水平与外周血浆和脑TNFα水平相关。
04 APP/PS1衍生的原代皮层神经元中的草甘膦暴露会增加可溶性淀粉样蛋白β40-42的水平并降低细胞活力
Aβ水平是AD病理学的标志。研究人员从APP/PS1幼崽中分离并铺板原代皮层神经元,并将它们与0µg/mL、10µg/mL、20µg/mL 或40µg/mL草甘膦共培养,并在24小时后从培养板中收集培养基并测量Aβ40-42的可溶性水平。研究发现Aβ40和Aβ42水平和细胞活力均对草甘膦有显著的剂量依赖效应。这些结果表明,当使用源自APP/PS1小鼠的原代皮层神经元进行体外测试时,体内大脑中检测到的草甘膦暴露水平足以以剂量依赖性方式增加Aβ40-42水平并降低细胞活力。
05 草甘膦暴露导致剂量依赖性转录组失调
为了表征草甘膦暴露后转录组的变化,研究人员从小鼠脑中分离RNA,并在Illumina HiSeq 2500上通过100 bp双端测序进行测序。差异表达基因(Differentially expressed genes,DEG)的FDR截止值设置为5%。DEG的初始剂量回归分析显示226个基因以剂量依赖性方式显著失调。为了检查这些基因的功能概况,使用基因本体(Gene Ontology,GO)、Kegg和Reactome数据库进行了通路分析。GO和Reactome分析显示没有功能富集,Kegg分析显示一个通路富集了11个失调基因。随后用于确定基因表达的细胞类型特异性变化的去卷积分析显示少突胶质细胞和GABAergic神经元显著富集。
ctDNA的提取在肿瘤筛查中,是重要的前置步骤。目前常用的提取方法是利用生物磁珠,主要是硅羟基磁珠或羧基磁珠对血清血浆的ctDNA进行提取,由于磁珠的粒径小,比表面积大,在特定提取缓冲液中,对核酸的吸附会更加灵敏,相比于其他方法,使用生物磁珠对进行ctDNA提取得率会更高,检测灵敏度和检出限也会更合适,搭配核酸提取仪,更能实现全程自动化的提取。