CRISPR基因编辑技术自问世以来，就表现出无可比拟的优势，并深刻改变了基因编辑领域乃至整个生命科学的研究模式。在原理上，以CRISPR-Cas9系统为例，Cas9蛋白在gRNA的引导下靶向与之互补的DNA双链并造成DNA双链断裂（DSB），从而在该基因位点造成插入或缺失突变。

值得注意的是，DNA双链断裂（DSB）后的细胞修复过程是难以控制和预料的，可能导致不必要的基因改变。如果能开发一种替代技术，可以在不产生DNA双链断裂的情况下改变基因，从而在保留CRISPR基因编辑技术优点的同时，还能提高其安全性和可操控性，这对科学研究和药物开发十分重要。

近日，美国哥伦比亚大学的研究人员在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Targeted DNA integration in human cells without double-strand breaks using CRISPR-associated transposases 的研究论文。

该研究报告了一种通过使用I-F型CRISPR相关转座酶（CAST）来避免产生DNA双链断裂（DSB）并在人类细胞中实现***段DNA定向整合的可编程集成方法，为利用CRISPR相关转座酶进行人类基因组工程奠定了坚实的基础。

CRISPR基因编辑技术因其易于编程性和***活性而广泛应用于基础研究、农业应用和医学治疗。然而，该技术会引发DNA双链断裂（DSB），并依赖于非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）进行修复。近期一些研究进一步强调了基于DNA双链断裂（DSB）的基因组编辑的不良事件，包括大规模基因组缺失、染色体易位和染色体碎裂等，这影响了基因编辑效果并可能造成严重的安全问题。

为了开发效率更高、安全性更好的基因编辑技术，***近的研究试图通过将Cas9融合到各种转座酶结构域以获得RNA引导的转座酶，但这些努力仍然依赖于DNA双链断裂（DSB）并且未能实现严格的特异性控制。相比之下，细菌的CRISPR相关转座酶（CAST）可以在不依赖DNA双链断裂（DSB）的情况下靶向插入***段DNA序列。

基于此，研究团队***近报道了使用源自霍乱弧菌Tn6677的I-F型CRISPR相关转座酶（CAST）系统在多种细菌物种中实现不依赖DNA双链断裂（DSB）的DNA插入，并证明该方法表现出精细的全基因组特异性，可以轻松实现单碱基精度的基因编辑。

人类细胞中蛋白质-RNA CAST成分的重组

在这项***新研究中，研究团队试图利用RNA引导CAST系统在哺乳动物细胞中进行靶向DNA整合。研究人员验证了不同CAST系统在哺乳动物细胞中的活性，并证明RNA引导转位的决定因子在其他细菌和和真核生物中也同样适用。

研究团队通过蛋白质设计优化了QCascade复合物的DNA靶向，并开发了一种RNA引导的AAA+ ATP酶TnsC的多价募集策略，并以此实现了与传统的基于dCas9相似的有效转录激活水平。

开发基于QCascade和基于TnsC的转录激活子来监测DNA靶向

在初步检测到基于质粒的整合后，研究团队从广泛的细菌宿主中筛选了15个CAST系统，从假交替单胞菌中鉴定出一个同源物，该同源物表现出更好的活性，并进一步提高了整合效率。

在游离型质粒中，基于RNA引导在人类细胞中使用不同的DNA整合

更重要的是，研究团队还发现，细菌ClpX是一个关键的辅助因子，它可以将基因组整合增强了两个数量级以上。这可能是ClpX通过促进整合后CAST复合体的主动分解，类似于它在Mu转位中的已知作用。

ctDNA的提取在肿瘤筛查中，是重要的前置步骤。目前常用的提取方法是利用生物磁珠，主要是硅羟基磁珠或羧基磁珠对血清血浆的ctDNA进行提取，由于磁珠的粒径小，比表面积大，在特定提取缓冲液中，对核酸的吸附会更加灵敏，相比于其他方法，使用生物磁珠对进行ctDNA提取得率会更高，检测灵敏度和检出限也会更合适，搭配核酸提取仪，更能实现全程自动化的提取。