脊髓性肌肉萎缩症 (Spinal muscular atrophy, SMA) 是一种渐进性运动神经元疾病，也是导致婴儿死亡的主要遗传原因【1】。SMA由生存运动神经元1（Survival motor neuron 1, SMN1）基因的纯合缺失或突变引起。但是一个或多个几乎相同（> 99.9％的序列相似性，实际上SMN1和SMN2仅有5个核苷酸不同）的SMN2基因可以部分补偿SMN1的缺失造成的缺陷【1, 2】，然而，SMN2基因中的一个C核苷酸改变成了T核苷酸，这导致其外显子7在转录过程中被跳过【3】。这个外显子缺失导致了SMN2基因所产生的蛋白质结构不稳定，并且缺乏功能，不能正确地执行其生物学作用。这种缺陷的蛋白质会被快速裂解，这就是为什么SMN2基因无法完全弥补SMN1基因的损失。由于这个核苷酸改变，SMN2基因的表达量和功能受到严重的***，这是导致脊髓肌肉萎缩症的一个重要因素。目前，未经治疗的***常见的SMA（I型）患者的存活中位数仅为6个月。

来自David Liu实验室在Science上发表了题为Base editing rescue of spinal muscular atrophy in cells and in mice，介绍了单碱基编辑改变SMN基因方法可***恢复SMN蛋白质水平并拯救SMA表型。研究团队使用核酸酶或碱基编辑器来修改五个SMN2调控区域，将SMN2的T6>C转换，将SMN蛋白质水平恢复到野生型。该方法在小鼠实验中取得了成功，平均寿命延长，运动功能得到改善。这些发现证明了一次性碱基编辑治疗SMA的潜力。

本文主要介绍了三种基因编辑策略，共79种具体方法来实现基因编辑。其中一种策略是通过删除位于ISS-N1区域的hnRNP A1/A2结合位点，提高SMN2中exon 7的转录率，进而提高SMN蛋白水平；另一种策略是通过破坏exon 8的后翻译调控序列来增加SMN蛋白的稳定性。此外，还可以使用BE-Hive预测模型，结合不同的碱基编辑酶和指导RNA，设计多种策略来修饰外显子7的调节原件。

首先，外显子7的转录受到下游内含子剪接沉默子ISS-N1的强烈影响，其中含有两个异质核糖核蛋白（hnRNP）A1 / A2结合位点。在3'hnRNP A1 / A2结合域内和下游的删除可以改善外显子7的转录。通过Cas9核酸酶介导的ISS-N1基因组位点的破坏可能会增加SMN2剪接中外显子7的转录，从而增加SMN蛋白水平。为了实现这一点作者使用了机器学习模型InDelphi来预测在ISS-N1区域进行编辑后的效果，并选择了9种不同的编辑策略进行实验。实验结果表明，所有***率（≥85%）的编辑策略都显著提高了exon 7的包含率，使SMN蛋白水平增加了17倍至13倍。这项研究表明，通过编辑ISS-N1基因区域可以稳定地增加SMA患者中SMN蛋白的表达，从而提高SMA患者的治疗效果。

其次，完整长度的SMN和不稳定的SMNΔ7蛋白之间的关键差异在于，由外显子7编码的16个氨基酸被EMLA代替，EMLA是由外显子8编码的四个残基的降解信号。将外显子8的编码序列扩展五个或更多异源氨基酸会掩盖SMNΔ7 C端的降解信号。这些修改后的SMNΔ7（SMNΔ7mod）蛋白变异体具有增加的稳定性，并且可以挽救严重SMA小鼠的生存和运动表型。于是研究人员设计了Cas核酸酶介导的外显子8破坏策略，以生成类似的稳定SMNΔ7mod蛋白，不同的策略可以不同程度地增加SMN蛋白的水平，***高达17倍。

图1：核酸酶和CBE编辑策略，以及在外显子8处破坏3'剪切受体位点的基因组编辑结果

***后，SMN2的外显子7中的几个单核苷酸替换强烈调控其剪接，包括在位置6的C到T的转换（C6T），这将SMN1（C）和SMN2（T）基因区分开来，以及在外显子7末端的T44C、G52A和A54G。利用现有和新开发的BE-Hive碱基编辑结果预测模型，作者确定了42种策略（碱基编辑酶和引导RNA的组合）来修改外显子7的剪接调控元件（SREs），还验证了这些策略在小鼠胚胎干细胞中的有效性。总之，使用不同的Cas9变体和编辑策略可以***地实现SMN2的单核苷酸编辑，并且基于BE-Hive预测模型的编辑结果与实际结果高度吻合。其中针对C6T的策略在实现***编辑的同时，可以保持高度精准的编辑质量，这可能有助于治疗SMA等相关疾病。

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