近些年，以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展。多项研究表明，大部分晚期NSCLC患者的血液中存在循环游离DNA（cfDNA）及循环肿瘤DNA（ctDNA）；并且已有研究显示外周血ctDNA EGFR基因突变检测结果对EGFR-TKIs疗效有预测作用。因此，当肿瘤组织难以获取时，无创、易采集的血液检测就是组织EGFR基因突变分析合适的替代选择，并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测等。

标准化的检测流程是保障ctDNA-EGFR血液检测质量的前提，临床专家对于血液检测应用规范问题也多有探讨，并于2015年12月8号在《中华医学杂志》上发表了由吴一龙、王洁等教授整理的《非小细胞肺癌血液EGFR基因检测中国专家共识》。其中，标本采集及处理、cfDNA的提取、EGFR突变检测是血液检测的三个重要环节。

一、血液EGFR基因突变检测之标本采集及处理

1、患者选择：研究显示，肿瘤分期越高，ctDNA检出率越高，即III或IV期的肿瘤患者血液中的ctDNA相较Ⅰ/Ⅱ期的患者含量更高，更容易被检出。因此，为提高血液EGFR检出率，建议选择晚期患者。

须知药物治疗过程中，EGFR突变情况以及ctDNA的浓度可能发生变化。如下图所示：

2、标本采集及分离：全血中血浆和血清均能分离出ctDNA，但研究显示，相对于血清标本，血浆中ctDNA有更高的检出率。另外，对同一患者，血浆量越多所提取的DNA量就越多，其中含有的cfDNA量就越多，对检测越有利，如下图所示：

因此按照专家共识建议采集10ml全血（可分离4-5ml血浆），采集完成后需温柔颠倒混匀，以便于抗凝剂或保护剂充分与血液接触。

此时需根据使用的采血管类型（常规EDTA抗凝管/专用常温采血管）进行不同的后续操作。

（1）：用常规EDTA抗凝管采集全血后，为防止游离DNA的降解，避免野生型DNA背景的增加，建议两小时内以足够的离心力将全血充分低温离心两次[11]，分离出不含细胞成分的血浆，吸取操作如下图所示，分离出的血浆放置于-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤（备注：离心前临时保存应暂放于2~8℃冷藏）；

（2）：用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管采集后轻摇混匀，常温放置不超过5-7天，以足够的离心力将全血充分离心两次，分离出不含细胞成分的血浆，放置于-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤。如果外送运输全血，建议使用cfDNA专用常温采血管。

禁用肝素抗凝管：由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取过程中难以去除，肝素也会导致PCR效率降低，因此cfDNA检测血液采集禁用肝素抗凝管。

3、血浆质量评价

（1）血浆是否溶血：如发生严重溶血，标本不可用，血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低。

（2）血脂是否过高：血脂过高，使血浆呈乳白色，低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用，故对PCR有干扰。

二、血液EGFR基因突变检测之cfDNA提取

10ml全血分离出的4-5ml血浆用于cfDNA的提取，目前可用于cfDNA提取的方法很多，有实验室自建方法，也有商用核酸提取试剂盒。建议采用国家药监部门批准的、大容量血浆游离DNA分离试剂盒。

所提取的cfDNA建议马上使用，若不能立即进行后续检测而需要储存cfDNA，***-80℃冰箱冻存。若无-80℃冰箱，可选择-20℃保存，应尽可能缩短冻存时间，尽快进行后续检测。冻存时注意密封及标记完整，避免反复冻融。

三、血液EGFR基因突变检测

中国国家食品药品监督管理总局（CFDA）在2015年2月批准吉非替尼说明书更新，可通过血液ctDNA检测EGFR基因突变指导吉非替尼治疗。近期，CFDA更是通过创新医疗器械特别审批的方式，快速批准艾德生物（股票代码：300685）自主创新产品Super-ARMS® EGFR检测试剂盒（Super-ARMS技术是在原有ADx-ARMS技术优势基础上，优化引物探针设计和反应体系，将检测灵敏度提升至0.2%，完全适用于对灵敏度要求更高的血液检测领域）用于血液ctDNA-EGFR基因突变的检测。由此可见，ctDNA-EGFR标准化检测的时代已经到来！

为了降低假阳性概率，推荐使用经国家药监部门批准的高敏感度的检测方法用于ctDNA样本的EGFR基因突变检测。专家共识中也指出，检测必须在具有资质的检测中心进行。检测方法必须进行严格的验证及质控。检测试剂须使用经CFDA批准的检测试剂盒。目前，检测基因突变***常用的方法是扩增阻遏突变系统(ARMS法)，欧盟批准用于指导吉非替尼治疗的血液检测方法也是ARMS检测方法。而Super-ARMS®方法是CFDA批准用于血浆中EGFR突变检测的敏感度***高的ARMS方法，其检测灵敏度可达0.2%。

根据今年ESMO（欧洲临床肿瘤协会年会）大会上，上海肺科医院周彩存教授、广东省人民医院吴一龙教授等多位肺癌权威专家共同发布的AURA 17扩展研究数据可知[12]，Super-ARMS® 技术检测血浆T790M突变的阳性检出率仅次于目前灵敏度***高的ddPCR技术，更重要的是，Super-ARMS®技术检出的血液T790M突变阳性患者服务奥希替尼的客观响应率（ORR）***高，高达64%，说明灵敏度0.2%的Super-ARMS®技术是临床血液ctDNA检测的***优选择，疗效预测的准确性***高，是血液检测临床应用的可靠技术。

总之，血液EGFR突变检测的标准化、合规化是保证检测准确率的核心，在减少操作流程对检测结果影响的前提下，选择经国家药监部门严格审批上市的检测产品和合规***的检测机构也是至关重要的。