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超越CRSIPR,线粒体靶向的ARCUS核酸酶,消除线粒体致病基因突变

作者: 发布时间:2024-07-01 浏览次数:197
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基因编辑技术在细胞核基因组的编辑中取得了辉煌的成绩,但是在线粒体基因组编辑中却滞后很多。开发针对线粒体DNA的基因编辑工具一直是线粒体遗传学领域的长期目标,也是研究和治疗线粒体疾病的有力工具。迈阿密大学米勒医学院和Precision公司的研究人员在 Nature 子刊 Nature Metabolism 上发表了题为:Efficient elimination of MELAS-associated m.3243G mutant mitochondrial DNA by an engineered mitoARCUS nuclease 的研究论文。

该研究开发了一种线粒体靶向的ARCUS核酸酶——mitoARCUS,该核酸酶被设计用于特异性靶向和切割线粒体DNA(mtDNA)的致病性m.3243G点突变。

在含有95%突变m.3243G的线粒体DNA的细胞中,mitoARCUS可以消除所有含有突变的线粒体DNA,而不影响正常线粒体。这些正常线粒体DNA随后能够被细胞快速复制,以保持线粒体DNA拷贝数的稳定。通过消除突变线粒体DNA并允许正常线粒体DNA的重新复制,mitoARCUS驱动了突变线粒体向健康线粒体的转变,这一过程被称为异质性转换(shifting heteroplasmy)。

该研究还通过AAV递送mitoARCUS的系统给药,证明了mitoARCUS在体内编辑线粒体DNA的有效性。这些实验数据支持了mitoARCUS作为m.3243A>G相关线粒体疾病的体内基因编辑疗法的开发。

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论文通讯作者、迈阿密大学米勒医学院的 Carlos Moraes 教授表示,迄今为止,线粒体疾病没有治愈性的治疗方法,基因编辑技术作为一种新方法,为线粒体疾病患者带来希望。 然而,许多基因编辑技术,特别是基于CRISPR的基因编辑技术,由于其复杂的多组件,一直无法有效地靶向突变的线粒体DNA,因此它们被认为不是线粒体疾病的有效治疗选择。mitoARCUS的简单性使其成为***种不仅能够区分m.3243A>G点突变,还能有效地消除这一点突变的方法,能够使正常的线粒体DNA在细胞内重新复制并恢复功能。这一令人兴奋的进展有望为患有m.3243突变相关原发性线粒体疾病的患者带来治愈性治疗方法,并且ARCUS技术将来还可能被应用于研究和治疗其他线粒体疾病。

线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作(mitochondrial encephalopathy,lactic acidosis,and stroke-like episodes),简称MELAS综合征,是一种多系统线粒体疾病,也是***常见的线粒体脑肌病。其具体症状因人而异,但通常包括反复卒中样发作、脑病和乳酸积累。完全症状患者出现神经系统症状后的中位生存时间约为17年,平均死亡年龄为34.5±19岁,目前尚无治愈这种疾病的方法。

MELAS综合征涉及多个线粒体DNA(mtDNA)基因突变,包括MT-TL1、MT-TK、MT-TQ和MT-ND5等,其中***常见的突变位点是在编码线粒体tRNALeu(UUR)的MT-TL1基因中。特别是,mtDNA的3243位点的A>G点突变(m.3243A>G)导致了>80%的MELAS综合征。此外,除了MELAS综合征,m.3243A>G突变还与多种其他临床表型相关,包括听力丧失、偏头痛、肌肉无力和糖尿病等,总体而言,m.3243A>G突变的人群患病率估计高达1/400。

ARCUS是由Precision公司的科学家发现和开发的专有基因组编辑技术。它使用序列特异性的核酸酶来切割DNA,能够在细胞和生物体体内实现对DNA的敲除和敲入。ARCUS基于一种天然产生的基因组编辑酶I-CreI重新设计改造而来,I-CreI是在莱茵衣藻中进化,可在细胞DNA中进行高度特异性切割,并通过同源重组实现在切割位点的基因敲入。

此前,Precision公司已经将不同的ARCUS核酸酶应用在了敲除胆固醇代谢基因、转甲状腺素蛋白淀粉样纤维生成基因、灭活乙肝病毒,以及构建同种异体CAR-T细胞等领域。

2021年,他们发现了一种线粒体靶向的ARCUS核酸酶——mitoARCUS,可以通过腺相关病毒9型(AAV9)进行系统性递送,在小鼠体内消除线粒体DNA的m.5024C>T点突变【2】。

对于线粒体DNA的基因编辑而言,ARCUS相比ZFN、TALEN以及基于CRISPR的可编程基因编辑技术具有几点优势:ARCUS是一种单组分蛋白质,可以同时识别DNA和产生DNA双链断裂(DSB),其大小仅为约1100bp,可使用单个AAV载体递送,而且,可以对其优化底物识别相关氨基酸,以提高活性和特异性,从而产生高度特异性的ARCUS核酸酶。

基于ARCUS的这些特点,以及线粒体DNA中m.3243G点突变的流行,研究团队开发并优化了一种能够特异性识别和切割线粒体DNA的m.3243G点突变的mitoARCUS核酸酶。

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添加了线粒体靶向序列(MTS)的mitoARCUS,可定位到线粒体

实验结果显示,mitoARCUS核酸酶具有高度特异性,能够***切割携带m.3243G点突变的线粒体DNA,从而通过异质性转换(shifting heteroplasmy),驱动正常线粒体DNA的复制,恢复线粒体功能。这一过程没有任何因消除突变线粒体DNA产生的瞬时线粒体DNA耗竭相关毒性。

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