肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种难以诊断、难以治疗、难以恢复的神经系统疾病，科研人员利用基于CRISPR-Cas9基因编辑开发的新应用加强对ALS的基因分子，这或许为未来该病的新药物靶点提供新的思路。

在基因编辑技术的新应用中，斯坦福大学医学院的研究人员利用该技术增强了对肌萎缩侧索硬化症（ALS）遗传基础的了解，这是一种神秘的退化性疾病，这种疾病的分析非常棘手。该团队的研究结果是迈向该神秘疾病进展的一步，甚至有助于为新的治疗目标奠定基础。

ALS也被称为Lou Gehrig病，侵蚀肌肉功能并损害大脑与人体交流的能力，使得简单的随意肌肉运动，如刷牙、说话甚至呼吸变得极其困难。 ALS属于一类神经退行性疾病，所有疾病都有共同的“特征”-脑内积聚的异常蛋白质团块。

在ALS中，这些蛋白质团块或聚集体被认为对神经元具有致命的毒性，***终导致疾病的破坏性身体症状。但细胞死亡的过程仍然在很大程度上是一个黑匣子。

“这些毒性蛋白质聚集体可能是驱动疾病的病理原因，但没有人真正知道它们是如何引起神经元细胞死亡的。这是我们在这项研究中想要探究的真正原因，”遗传学教授Aaron Gitler博士说。Gitler's和Bassik的实验室使用CRISPR-Cas9基因编辑技术对整个人类基因组进行分类，挑选出帮助神经元维持抗毒蛋白质的基因。一些基因不仅使研究人员对疾病本身有了更深入的机制认识，少数位点似乎也有潜力成为药物的新靶点。

描述这项研究的论文将发表在3月5日的Nature Genetics杂志上。

CRISPR-Cas9 KO在初级小鼠神经元中的筛选

1、一个简单但致命的蛋白质

C9orf72基因突变是ALS相对常见的原因，这一发现有助于着手理解ALS如何在分子水平上起作用。在ALS中，突变的C9orf72基因含有一个巨大的重复DN***段，当该部分基因错误地变成各种毒性蛋白质时，它们会粘合神经元功能并导致细胞死亡。

“在一个健康的人身上，你可能会看到10到20个这样的DNA重复，”Haney说。 “但是在ALS中，它们扩展到数百乃至数千个重复片段，这就是生产这些有毒蛋白质的模板。”

Gitler和Bassik着手回答两个基本问题：

毒性蛋白质如何消除健康的神经元？

是否还有其他基因能够抵御或反过来加剧脑中毒蛋白的作用？

研究人员并没有单独查找人类库中的每个基因，而是采用了一种称为全基因组筛查的策略，该策略利用CRISPR-Cas9同时改变每个人类基因的功能。在这种情况下，他们利用这项技术生产出“基因敲除”的效果，用一种能够精确切割的分子剪刀靶向基因，使其无法执行正常功能。

Kramer解释说，基因敲除可以帮助研究人员发现能够增强毒性或预防基因的基因：如果您确定了一个基因并将其敲除，并且ALS蛋白重复不再有毒，那么您知道该基因实际上不存在保护神经元免于退化。也许更重要的是，它可能是一个潜在的药物靶点。

2、Tmx2：细胞死亡的哨兵

TMX2的减少提高了C9-ALS iPSC衍生的运动神经元存活率

在系统地敲除人类基因组中的每个基因并测量细胞中ALS蛋白的毒性后，研究人员发现，大约200个基因被敲除后，有助于保护细胞免受毒性蛋白质或使其更容易受到伤害。为了将一小部分基因归零，Haney和Kramer在小鼠神经元中随后进行了两次随后的敲除筛选。

他们发现了一些特别有力的保护者。例如，其中一个有助于阻断毒性ALS蛋白渗透细胞并破坏细胞的关键入口。但是另外还有一个蛋白质，因为它神秘的抵抗神经死亡的能力而引起了该研究团队的注意。该基因通常编码称为Tmx2的蛋白质，其在称为内质网的一部分细胞中发现。

“我们可以想象Tmx2可能会成为很好的药物靶点候选者，”Haney说。 “如果你有一个小分子可能会阻碍Tmx2的功能，那么可能有一个治疗窗口。”

目前，Tmx2在内质网中的作用尚不完全清楚。但它被认为参与了对各种环境压力因素的反应，特别是那些触发细胞死亡的因素。根据这项研究的发现，它可能是其他基因的调节剂，引发细胞死亡过程。

“我们仍处于早期阶段，但我认为确切了解Tmx2通常在细胞中做什么是一个很好的开始 - 这将暗示当这些有毒物质杀死细胞时哪些功能受到干扰，并且可能指向我们应该研究哪些路径，“克莱默说。

更广泛地说，本研究中的CRISPR筛选已用于研究一系列疾病途径。但该团队表示，这是他们***次认识到，全基因组人类CRISPR敲除筛选已被用于发现关于神经退行性疾病的线索。 Gitler和Bassik目前正在合作使用这种相同的方法来了解ALS甚至其他神经疾病，如亨廷顿舞蹈症，帕金森氏症和阿尔茨海默氏症。“我认为这是CRISPR屏幕的一个非常令人兴奋的应用，这只是一个开始，”Bassik说。

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