sugarcane(甘蔗)多倍体无参考基因组取材：取自根、茎、叶不同的生长阶段具有22个特性的混合样本测序平台：Pacbio RS II 与Illumina取材：取自根、茎、叶不同的生长阶段具有22个特性的混合样本二代文库：插入片段200b

 sugarcane(甘蔗)多倍体无参考基因组

 取材：取自根、茎、叶不同的生长阶段具有22个特性的混合样本

 测序平台：Pacbio RS II 与Illumina

 取材：取自根、茎、叶不同的生长阶段具有22个特性的混合样本

 二代文库：插入片段200bp

 结论：总共获得107,598条unique transcript isoforms，呈现了约71%的unigene,其中约有92%可比对到已知植物蛋白库。约有2%的新转录本以及约2%的LncRNA。分别有56%和23%的序列可注释到GO和KEGG数据库。相同条件比较三代和二代转录本，其中有62%的三代转录本匹配到67%的二代拼接转录本。与高粱基因组比对，分布有69%的三代转录本和41%的转录本比对率。

 分析内容简述：

1. 二代转录组数据组装，使用了Trinity r2013-08-14, CLC-GWB, Velvet/Oases v1.2.10 和SOAPdenovo-Trans v1.03多种软件分别组装并***后使用CD-HIT-EST v4.6.5 进行结果整合

2. 组装结果完整性评估借助BUSCO的数据库进行评估

3. 三代数据的前期预处理都是基于三代官方的smrtanalysis分析软件完成

4. 结合二代数据使用LoRDEC分析软件对三代数据进行矫正，大大提高了三代获得***终转录本的数量

5. 基于TransDecoder 的开放阅读框及编码潜能预测分析

6. 非编码RNA预测分析

7. 使用RepeatMasker v4.0.6 对重复序列transposable element (TE) 进行分析

8. 使用MISA v1.0 对SSR短重复序列进行分析

9. 使用blastn比对NT数据库（<1e-5）进行比对注释分析，其中还包括植物转录因子数据库PlantTFDB v3.0 注释分析，以及常规的GO/KEGG数据库注释分析

 结果与分析方法解读

1. 之前测了二代现在补测三代，两者一个很好的结合点是什么？

使用二代数据对三代数据进行矫正，目前矫正的方法有很多比如proovread and LoRDEC，通过本文的比较LoRDEC的效果会更好。另外对二代的数据输入方面也不是不假思素的有多少就输入多少，而是通过对二代输入数据首先进行标准化，这里采用的标准化方法采用了Trinity-normalized和BBnorm-normalized两种方法，并与非标准化方法矫正的结果进行比较，***终确定了Trinity-normalized+LoRDEC***佳整合形式。注意这一发现和研究成果已经整合到欧易生物的全长转录组分析中。

2. 关于完成性评估内容

之前的数据完整性评估是基于CEGMA（http://korflab.ucdavis.edu/datasets/cegma/）标准的，但是由于该项目早在2015年5月18号就已经停止更新了，而且该项目主页在分析过程中也推荐使用BUSCO（http://busco.ezlab.org）数据库标准。因此还没有对此更新的小伙伴们抓紧了。

3. 关于三代测序平台

由于本文是发表于2017年，但测序仪器的选择还是RSII平台。目前市场上的三代测序平台都是基于Pacbio公司的有Sequel和RSII两种。Sequel是RS II的升级版本，两者相比Sequel的自动化程序更高，减少了人为操作，且数据通量高和数据一致性较好。简单的通过全长转录组建库测序的流程图来看懂两者仪器的区别。

4.关于三代全长转录组测序除了在RNAseq测序方面的应用还有那些：

在做基因组denovo的时候，基因预测往往是一个很大的难题，无论是基于

参考基因组训练模型进行基因预测的denovo方法，还是基于蛋白质同源比对的同源比对方法，都没有基于RNAseq的转录组数据预测方法来的更直接和准确。三代全长转录组测序由于免去了组装这一步骤，因此在经过后期的数据处理和矫正后，得到往往就是真实的转录本。常规情况下，我们在做基因预测时，基于denovo方法占的权重是1，同源比对所占比例为5，而转录组数据所占比例却为10，其重要性一目了然。

不论是几代测序，核酸提取与纯化的步骤都必不可少，G.N.T.公司生产的磁珠法核酸提取试剂盒能够高通量自动化地进行核酸提取与纯化，非常适用于测序平台用于样品前处理。