从时间上看，ZFN是***早的，接着是TALEN，***后是CRISPR。每一次成功的交替，都伴随着操作更简便、应用更普及。CRISPR的出现，大大简化了基因编辑的操作，因此被研究人员广泛采用。尽管如此，ZFN和TALEN仍被人们认为在基因治疗中前途光明，因为它们比CRISPR更加精确。

基因编辑对生物医学研究的影响不亚于30年前的PCR。近年来，锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应子（TALEN）和规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）已经掀起了一浪又一浪的基因编辑***。

从时间上看，ZFN是***早的，接着是TALEN，***后是CRISPR。每一次成功的交替，都伴随着操作更简便、应用更普及。CRISPR的出现，大大简化了基因编辑的操作，因此被研究人员广泛采用。

尽管如此，ZFN和TALEN仍被人们认为在基因治疗中前途光明，因为它们比CRISPR更加精确。Schaefer等人近期在《Nature Methods》上发表文章，通过深度测序揭开CRISPR的脱靶效应。作者指出：“我们发现了大量意想不到的单核苷酸变异，而不是像人们普遍认为的那样，CRISPR主要在与sgRNA同源的区域产生插入缺失。”

“CRISPR的简便让基因组编辑迅速普及，改变了疾病研究的面貌，”MilliporeSigma的基因编辑负责人Martha S. Rook博士谈道。“然而，对于那些需要知识产权***的关键研究，成熟的基因编辑技术（如ZFN和TALEN）仍然是***方法。”

重回ZFN？

CRISPR是依赖基因靶向的向导RNA来结合特定的序列，而ZFN则不同，它是由蛋白构成的。这些结构域蛋白经过优化，可提高精确度和特异性，适合临床基因编辑。

据Sangamo的副总裁Michael Holmes博士介绍，ZFN需要的蛋白改造知识比CRISPR要多。“这也就是为什么研究人员在考虑基因编辑时，***时间想到CRISPR，但对于治疗而言，***简单的也许并不是***好的。”

2015年12月，美国FDA批准了Sangamo的B型血友病治疗方案（SB-FIX）。这种方案是在患者肝脏细胞的白蛋白基因位点中插入治疗基因。“当我们将治疗基因插入这个非常强大的启动子时，我们能够将肝脏作为蛋白生产工厂，这样只需要编辑少量肝细胞就能产生治疗水平的蛋白，”Holmes说。

这种经过优化的ZFN有着出色的特异性，且脱靶修饰的水平低于深度测序的检测极限。“在基因组指定的位点获得80%以上的编辑效率，且脱靶效应低于检测限，这种能力正是治疗性的基因编辑所需要的，”Holmes补充说。

Sangamo的锌指平台对基因组所做的修饰在遗传上是稳定的。试剂的作用是瞬时的，但它们赋予的性状却是***的。“天然的进化动力当然存在，这会导致细胞在许多代后不***，或丢失染色体。不过，它与未经过编辑的基因组相比既没有增加，也没有减少，”Holmes解释说。

Proxy-CRISPR

当然，CRISPR在许多应用上还是具有独特的优势。Rook认为，CRISPR设计简单，让研究人员能轻松获得现成的CRISPR全基因组文库。此外，与ZFN和TALEN相比，它的切割效率提高，也增加了其在全基因组筛选和单个靶点编辑中的应用。

MilliporeSigma***近宣布对CRISPR进行改进，以便让这个工具更加***、灵活和特异。他们将利用Proxy-CRISPR来接近那些之前无法触及的基因组区域，从而加速药物开发和基因治疗。这种方法***近表达在《Nature Communications》杂志上。

Proxy-CRISPR利用CRISPR的两次结合来实现***切割。***次结合是利用缺乏DNA核酸内切酶活性的Cas9；第二次是通过同样无法单独切割人类DNA的CRISPR系统。据Rook介绍，这种策略是模拟天然存在的现象，因为许多不同的CRISPR系统与不同的DNA序列结合。

Proxy-CRISPR允许DNA靶点是多样化的，就好像许多个体的致病位点都有所不同。“为了纠正各种可能的致病突变，这就需要编辑技术能够靶定几乎所有的DNA序列，”Rook谈道。“Proxy-CRISPR方法为使用各种CRISPR变体打开了大门，它们能够揭开基因组差异的意义。”

灵活应用

Poseida Therapeutics也发现，CRISPR技术的改进能够克服脱靶效应。这家公司***近发布了临床前数据，表明它家的高保真基因组编辑系统NextGEN™ CRISPR可以产生“***供血者”嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）。大家都知道，这是癌症免疫治疗的重要平台。

Poseida目前已经积累了多个基因编辑平台。除了NextGEN CRISPR，Poseida还采用piggyBac™ DNA修饰系统、XTN™ TALEN位点特异核酸酶以及Footprint-Free™基因编辑。

“对于不同类型的细胞而言，没有一种永远无敌的技术，具体要取决于你想做什么，”Poseida的CEO Eric Ostertag说。“CRISPR试剂设计起来更简单、更快速，比TALEN也略为便宜。但是，如果你有TALEN的经验，并且打算上临床，那么成本和设计上的差异几乎可以忽略不计。”

NextGEN CRISPR的优势在于它可以应用在活化和静息的T细胞，这与很多只作用在活化细胞上的技术相比就具有更大的灵活性。Ostertag表示：“干性表型对产品效果和持续时间都是至关重要的，因此我们倾向于改造静息细胞。”NextGEN CRISPR在静息T细胞上效果很好，但TALEN不行。

野生型的CRISPR利用Cas9蛋白和向导RNA来切割DNA。作为天然的核糖核蛋白，它的切割效率很高，但非常马虎，带来一些不想要的脱靶突变。Poseida的NextGEN CRISPR则使用了类似锌指和TALEN的核酸酶，需要两部分同时存在才能切割，从而保证了on-target的特异性。

基因编辑的前提和基础是基因检测，离不开核酸提取与纯化的过程。G.N.T.公司生产的生物磁珠及磁珠法核酸提取试剂盒，配合核酸自动提取仪，可以高通量自动化地进行核酸提取与纯化。 为基因相关研究提高了效率降低了人力资源消耗，是众多相关实验室的***佳选择。