以二代测序和数字PCR为代表的基因检测技术的进步，为乳腺癌循环肿瘤DNA相关研究奠定了基础。2014年，美国病理学会颁布了二代测序临床检测实验室标准，为规范基因诊断提供了参考蓝本。2015年，欧洲人类遗传学会明确指出在依据指南建立研究并获得共识以前，二代测序技术尚不能指导临床实践。尽管现有研究结果显示，循环肿瘤DNA在乳腺癌病情监测、预后分析及个体化用药指导方面具有良好应用前景，但规范检测技术流程、严格判读标准的工作任重道远。

　　对肿瘤组织标本进行基因检测并个体化指导临床肿瘤综合治疗始终受到关注。近年来，二代测序及数字PCR检测技术的进步，推动了液体活检技术进入临床的进程。研究乳腺癌循环肿瘤DNA（ctDNA）检测与临床及病理之间的相关性，规范ctDNA检测的判读标准，正在成为乳腺肿瘤领域新的研究课题。

　　一、乳腺癌基因检测研究现状

　　与肿瘤相关的基因突变引起细胞内信号转导通路异常转导，构成肿瘤发生、侵袭、转移、耐药的分子基础。针对肿瘤组织标本开展的基因组学水平的研究为更新临床思维理念提供了新的探索方向。

　　2016年5月，《自然》（Nature）发表了迄今为止较大规模乳腺癌全基因组测序研究成果，通过分析560例乳腺癌组织的全基因组序列，共发现93个可能与乳腺癌发生相关的编码基因的1628个突变，其中10个***常见的突变基因占全部突变的62%，在95%的检测样本中至少存在1个驱动基因[1]。该研究组同时利用基因印记技术对560例乳腺癌发生过程中的基因变化机制进行了分析[2]。该课题组的研究结果提供了包括乳腺癌相关基因种类、突变发生频率等重要信息，为后续乳腺癌基因研究提供了重要的参考依据。同时，研究发现的乳腺癌基因突变高度异质性的特点也为临床个体化诊治提出更精准的要求。

　　与大规模基因组学研究并行，单基因研究也不断深入，部分热点基因的临床应用前景已初步呈显现。其中ERBB2基因扩增乳腺癌患者应接受抗人类表皮生长因子受体2（HER2）治疗的理念已获得临床广泛共识；BRCA基因突变乳腺癌对侧乳腺癌发生率高于普通乳腺癌患者，选择预防性乳腺切除正在受到关注。

　　二、AJCC第8版乳腺癌分期系统推荐多基因检测预后分析

　　基因表达谱技术已用于在分子水平上揭示乳腺癌异质性的本质。其中，利用多基因检测对乳腺癌预后进行评估已进入临床。一项大型三期随机临床试验TAILORx研究于2015年公布的结果显示，肿瘤***大径1.1～5.0cm（或***大径0.6～1.0cm，中***别核分级或组织学分级）、激素受体阳性、HER2阴性、淋巴结转移阴性、OncotypeDX复发风险评分＜11分的浸润性乳腺癌患者，仅采用辅助内分泌治疗其5年无病生存率达99.3%[15]。AJCC第8版乳腺癌分期系统正式纳入以OncotypeDX多基因检测为代表的5种多基因检测技术，分别以Ⅰ类或Ⅱ类证据加以推荐，并规定检测的适应证为T1-2N0M0期、雌激素受体阳性、HER2阴性乳腺癌[16]。

　　三、肿瘤基因检测技术与规范

　　目前基因检测技术种类繁多，包括以核酸分子杂交为基础的荧光原位杂交技术及基因芯片技术、以PCR为基础的实时荧光定量PCR技术及数字PCR技术（dPCR）和直接测序技术。随着学者对检测效率、灵敏度、特异度及精密度要求的不断提高，二代测序及dPCR分别在检测范围及精确度两个维度拓展了基因水平研究的能力，当前备受关注。其中二代测序在基因组水平为筛查肿瘤相关基因突变提供条件，dPCR可以通过检测基因拷贝数实现特定基因突变的***定量分析。

　　1、二代测序：二代测序通过高通量测序，可以同时对上百万条DNA分子进行检测，提高了测序速度，降低了单个碱基测序成本。根据测序基因范围，二代测序可分为全基因组测序、全外显子测序及靶向测序。测序深度指基因组在测序过程中被重复测序的次数。测序深度越高，测序的灵敏度及特异度越高，测序的时间及成本随之升高。目前，二代测序检测血浆标本中肿瘤相关基因突变的可行性已经获得认可，其测序深度可满足ctDNA检测所需的灵敏度。文献报道乳腺癌血浆ctDNA测序深度从288×-8248×[17]至×4163-65357（中位数×18875）[18]不等。同时，必须注意，二代测序进行ctDNA检测研究应对肿瘤组织及正常细胞进行测序，以满足验证突变基因来源、验证技术灵敏度和特异度指标价值，以及质量控制的要求。

　　2、dPCR：比较相对定量的传统PCR技术，dPCR通过测量特定基因的拷贝数实现了***定量。目前，dPCR检测乳腺癌血浆样本中ctDNA突变基因的灵敏度可达0.01%[19]，即可以检测到1万个基因拷贝中的一个突变基因。但是，dPCR无法进行大规模基因测序，只能针对已知特定基因进行定量检测。由于其灵敏度及对突变的定量方面优于二代测序，可以用于对二代测序的结果进行验证，或对前期筛选出的基因突变进行定量分析。

　　3、二代测序技术规范与指南：随着二代测序临床应用日渐普及，规范二代测序技术已成为亟待解决的问题。2014年，世界公认的权威实验室管理和认证组织——美国病理学会组织的二代测序工作组发布了二代测序临床检测实验室标准[20]；2015年，在遗传学领域具有重要学术地位的欧洲人类遗传学会发布二代测序诊断指南，开宗明义地指出：二代测序在依据指南建立研究并获得共识以前，尚不能指导临床实践[21]。

　　两份权威性文件对二代测序实验室操作、原始数据生物信息分析等各个环节高度相似地提出规范化要求。（1）标准化：推荐采用标准化的指标（灵敏度、特异度、准确度、精密度等）对二代测序检测进行评价。美国病理学会标准提出测序结果文件储存格式的标准化及操作过程中标准化作业程序的重要性。欧洲人类遗传学会指南引入评分系统概念，对二代测序结果进行分级，可以使不同实验室间的结果具有可比性，并具体规范了二代测序检测报告的内容及格式。（2）可追溯性：强调对二代测序检测过程细节及步骤结果进行记录，测序全程可追溯。美国病理学会标准引入异常日志概念，对任何偏离标准流程的过程、检测中的意外情况如实记录。（3）质量控制：强调二代测序任何过程均需要严格校正，技术更新等原因造成某一过程变化，整个检测过程均需重新校正，以确保质量稳定。

　　2016年8月，中国食品药品检定研究院也发布了《第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则》，旨在保证我国二代测序技术检测试剂产品质量、规范检测进程。

　　四、液体活检与乳腺癌ctDNA检测

　　获得详实的组织病理信息及遗传信息是制定肿瘤治疗决策的关键。传统的肿瘤组织活检创伤大、难以反复进行或取材困难。利用外周血进行的液体活检，具有无创、可重复和实时检测的优点。目前液体活检主要包括循环肿瘤细胞（CTC）、ctDNA、微粒体及外泌体检测。

　　1、CTC检测：CTC指进入外周血的肿瘤细胞。2004年，CTC检测系统获得美国食品药品监督管理局批准应用于临床。2010年AJCC第7版乳腺癌分期系统在原有的基础上增加cM0（i+）的概念，CTC成为判断依据之一；但cM0（i+）并不改变TNM分期[22]。AJCC第8版乳腺癌分期cM0（i+）定义不变，但进一步肯定了CTC的临床价值，并明确晚期乳腺癌CTC≥5个/7.5ml，早期乳腺癌CTC≥1个/7.5ml提示预后不良[16]。

　　2、ctDNA检测：ctDNA是指循环系统中游离、并携带有肿瘤相关基因信息的DN***段。ctDNA检测的灵敏度较CTC更高，临床前景受到广泛关注。但是，血浆ctDNA占全部循环游离DNA的比例＜1%[23]，其研究发展需要依赖二代测序及dPCR技术搭建的检测平台。二代测序检测相关指南的出台为规范检测评价标准及流程提供了基本保障。

　　3、乳腺癌ctDNA检测现状：主要涉及病情监测及预后分析、分子诊断及用药指导方面。

　　疾病检测及预后分析方面，由于晚期乳腺癌血浆ctDNA含量高，通过定量分析ctDNA动态变化，监测晚期患者疾病进展，预测复发的可行性***先取得成果。2013年Dawson等[24]利用二代测序结合dPCR技术，监测转移性乳腺癌治疗期间PIK3CA及TP53突变基因水平的动态变化，证明ctDNA可以有效地反映转移性乳腺癌肿瘤负荷，与CA15-3及CTC相比具有更高的灵敏度。随后Beaver等[25]论证了ctDNA检测在早期乳腺癌应用的可行性。通过检测肿瘤组织PIK3CA基因突变，再利用dPCR技术在患者血浆样本中寻找相应突变，其检测灵敏度为93.3%（14/15），特异度为100%。而Garcia-Murillas等[26]及Olsson等[27]报告的研究结果也分别证实了术后ctDNA检测在早期乳腺癌中发现微小残留病灶及预测复发中的价值。

　　由于ctDNA包含来自全部肿瘤克隆中的遗传物质，能够反映肿瘤遗传信息的全貌，同时ctDNA检测较传统组织活检具有重复性强的优势；因此，利用ctDNA监测治疗期间相关耐药基因突变的动态变化，并对药物导致的肿瘤克隆变化进行分析，有助于临床医师及时调整治疗方案[28]。除监测耐药外，ctDNA在寻找药物靶点、指导靶向治疗中的价值也值得期待。学者对51例乳腺癌患者组织学标本进行二代测序，其中84%的患者发现至少一个靶向药物靶点[29]。若能通过ctDNA检测寻找药物靶点并利用相应靶向药物进行个体化治疗，将是精准医疗较理想的诠释。

　　五、总结

　　在肿瘤基因研究逐渐深入，基因检测技术快速成熟的基础上，ctDNA在乳腺癌诊治方面前景广阔，但是其检测尚未真正进入临床实践。2016年10月我中心对76例早期乳腺癌（Ⅰ期30例、Ⅱ期44例、Ⅲ期2例、Ⅳ期0例）进行外周血浆ctDNA检测，共筛选获得突变319个，涉及18个基因，覆盖46个样本；基因突变检出率60.5%（46/76），提示早期乳腺癌较高的ctDNA检出率；但是，对基因突变与TNM分期及分子分型的相关性分析并未获得阳性结论，客观反映了ctDNA检测距离实际指导临床仍有距离，尚需更深入的研究。而规范检测技术流程，严格判读标准也需要大量工作。从基础研究到临床应用的转化将是精准医学时代的重要标志，达到这一目标之前，我们仍面临相当多的挑战。