近日，测序中国特邀南京世和基因生物技术有限公司（以下简称世和基因），以世和基因大量ctDNA检测实战经验（>50000例ctDNA检测）为基础，对该文章得出的一系列意见进行解读。

***部分：ctDNA检测流程指导意见 

1. 患者选择：临床肿瘤特征影响ctDNA释放

ctDNA释放与多种因素都可能相关，包括肿瘤分期、肿瘤类型、肿瘤部位、肿瘤活跃程度等等。

世和基因表示，2015年至今，公司从大量ctDNA临床检测经验中，总结了包括肿瘤分期、肿瘤类型、转移部位、用药疗效等一系列临床特征对ctDNA释放的不同影响，依此制定了严格的标准，以筛选出更适合进行ctDNA检测的患者，提高ctDNA检测的临床获益率。

图1：ctDNA释放相关临床特征统计

2. 样本类型：可选择血浆样本中ctDNA进行检测

相比血清，血浆中正常组织释放的cfDNA比例较低，可以更好的降低ctDNA检测的背景噪音，提高ctDNA的检出率。因此，血浆样本比血清样本更适用于ctDNA检测。

世和基因在ctDNA检测产品的研发阶段的验证实验中即同样证实血浆样本ctDNA检出率显著高于血清样本。同时，世和基因***新研究成果还发现胸腹水、脑脊液等体液样本的上清相对血浆样本ctDNA检出率更高。

图2：胸水上清相比血浆样本ctDNA检出率更高

3. 样本采集处理：采用EDTA管收集血液，并在6小时内离心分离血浆

血液中白细胞破碎后其基因组DNA进入血液，这些非肿瘤来源的DNA可能造成大量背景污染，因此血液采集后需要及时分离血浆。文中提出采用普通EDTA管收集血液后，必须在6小时内离心分离血浆。即使采用特殊细胞保护型采血管，也必须在48小时内完成离心。如需低温保存或运输，冷冻前需要先分离血浆。

世和基因介绍，公司在ctDNA检测产品的研发阶段已完成样本收集方面的大量优化实验，比较了多种条件下的ctDNA检测情况：结果显示EDTA抗凝管收集血液后2小时内离心分离血浆时，ctDNA检出率***高。世和严格保证所有血液样本收集2小时内完成血浆分离。

4. ***低检出限：不同检测方法及分析流程下，ctDNA***低检出限存在差异

目前多种检测技术可用于ctDNA检测，以PCR为基础的检测技术主要用于单个或少数几个已知位点的ctDNA检测，而NGS 技术的单次检测范围往往大得多。不同检测技术以及分析流程下的ctDNA***低检出限存在差异。

据悉，世和基因目前已与临床专家开展大量ctDNA临床课题研究，多项学术成果已成功发表，并积极参与ctDNA检测共识的建立，促进ctDNA检测逐步走向规范化 。

5. 检测数据解读：需要区分种系突变和克隆性造血突变

ctDNA检测可能受患者种系突变的影响：ctDNA中肿瘤特有突变丰度一般偏低，而种系突变丰度一般接近50%（杂合）或100%（纯合），所以可通过突变丰度结合数据库对比将种系突变加以区分。5%~10%的老年人会发生克隆性造血，体现为血液中存在低丰度的克隆性造血相关基因突变，这些突变与肿瘤治疗无显著相关性，但较难与肿瘤特有突变进行区分。

据世和基因介绍，对于参加液态活检检测项目的所有患者，世和基因均同时对血浆ctDNA和白细胞阴性对照进行平行检测，依此将肿瘤特有突变和种系突变及克隆性造血突变区分开来，以提高ctDNA检测准确性。 

第二部分：ctDNA检测临床应用 

应用1——指导晚期肿瘤患者药物选择：ctDNA检测阴性的患者，需进一步检测组织样本进行验证

血液中ctDNA含量较低。ctDNA检测阳性时，可直接指导患者用药选择；而ctDNA检测阴性时，需进一步收集患者肿瘤组织样本进行验证，根据验证结果指导用药选择。

图4：ctDNA在晚期肿瘤中的应用流程

因此，世和基因提倡组织、血浆、胸腹水、脑脊液等多种样本同步检测，既有多种类型样本相互验证提高检测结果准确性，也可以帮助揭示肿瘤的时间及空间异质性。对于部分只提供血浆样本的患者，世和基因在送检前展开严格患者筛选；检测后，进一步严格区分ctDNA全阴性患者和ctDNA驱动突变阴性患者，对于ctDNA全阴性的患者，我们提供组织样本再次送检机会。

应用2——复发监测及预后预测：仍需更多研究验证

目前有研究表明，与CA125、MUC1、CA19-9等传统肿瘤标志物相比，ctDNA可能是更好的复发监测标志物。但目前研究数量以及涉及到的样本量仍有限，因此有待开展更多大样本量研究进行验证。

目前，世和基因已与肺胃肠肿瘤等多领域临床专家开展了多项多中心／单中心临床研究，专注ctDNA复发检测及预后预测，积累ctDNA在中国肿瘤患者复发监测和预后预测方向的临床数据，促进临床转化。

应用3——早期肿瘤诊断和筛查：尚处于研究阶段

基早期癌症由于肿瘤负荷较小，释放到血浆中的ctDNA含量极低，目前尚无足够证据支持ctDNA用于早期肿瘤临床诊断和筛查。

早期肿瘤患者血浆中ctDNA的含量极低，对检测灵敏度要求非常高。世和基因自主开发了检测灵敏度达万分之三的ATG-seq新技术，为后期ctDNA在早期肿瘤诊断和筛查研究的开展提供技术支持。